中國科學院成都生物研究所功能生物大分子和生物檢測學科組發(fā)展了一個全新的核酶細胞內分子間篩選策略：以一個毒性蛋白（IbsC）為報告基因，在大腸桿菌中通過核酶對其mRNA的剪切來調節(jié)毒蛋白的表達——如果核酶活性較低，IbsC可有效表達而導致細菌死亡；當核酶具有較高活性時，毒性蛋白的表達下降細菌則可以在篩選平板上生長出菌落（如圖1A）。因此在錘頭核酶的催化活性中心和突環(huán)處引入隨機突變建立篩選文庫（圖1B），經(jīng)過多輪篩選，通過基于毒蛋白的篩選策略成功獲得多個錘頭核酶突變克隆（圖1C），隨后通過測序獲得了10個具有活性的錘頭核酶突變體。
圖1（A）核酶的細胞內篩選策略；（B）篩選庫設計；（C）篩選結果。
由于基于毒蛋白的篩選體系難于定量分析篩選出來的核酶在細胞內的剪切效率，他們隨后設計了一個基于雙熒光蛋白的報告體系來定量對比不同核酶之間的剪切效率（圖2A）。用紅色熒光蛋白的基因替換毒蛋白基因作為報告基因，通過改變核酶的底物結合序列使得核酶靶向紅色熒光蛋白的mRNA,同時融合表達了綠色熒光蛋白的基因作為內參，可以通過流式細胞儀檢測細菌紅色熒光相對綠色熒光的降低程度來評估核酶在細胞內的敲降效果。雙熒光報告體系結果表明，篩選的核酶中有三個突變體（TX-2，TX-5，TX-9）比野生型核酶對細胞內的靶基因的敲降效果更好（圖2B），其中TX-2對紅色熒光的敲降效率是野生型核酶的2倍。為確定核酶對靶基因的剪切是否在不同的RNA序列上的通用性，他們又選擇了紅色熒光蛋白上另外兩個位置進行剪切，TX-2在三個剪切位置對靶基因的敲降效果表現(xiàn)出了穩(wěn)定一致的高效催化活性（圖2C和D）。
圖2. 錘頭核酶HHRz對大腸桿菌紅色熒光蛋白基因的敲降
由于TX-2是在原核細胞中獲得，隨后考察了TX-2在真核細中的基因的敲降能力: 首先在癌細胞Hela中對比了篩選獲得的核酶對紅色熒光蛋白的敲降效率，結果表明TX-2的敲降效果顯著好于野生型核酶；隨后，以斑馬魚的體細胞色素沉著基因（nacre）為核酶的靶標，研究核酶在動物模型上對特定內源基因的敲降（圖3）。結果表明，注射表達TX-2質粒的斑馬魚與野生型核酶注射的魚相比，體細胞色素沉著明顯減少，RT-PCR的結果也表明TX-2會引起nacre基因在RNA水平上顯著減低（圖3A）。又以斑馬魚的尾部發(fā)育基因（ntl）為靶標進一步驗證TX-2的敲降效率，結果表明TX-2比野生型核酶具有更好的靶基因敲降效果（圖3B），注射TX-2核酶導致超過27%的斑馬魚出現(xiàn)典型的無尾表型。這些結果說明TX-2可以作為一個有效的工具用于細胞內的基因敲降。
圖3 （A）TX-2對斑馬魚紅色熒光蛋白基因的敲降；（B）（C）TX-2對斑馬魚nacre基因（控制色素沉著）的敲降；（D）TX-2對斑馬魚ntl基因（控制尾部發(fā)育）的敲降
綜上所述，通過體內篩選方法得到的核酶TX-2無論在原核還是在真核細胞內都表現(xiàn)出比野生型錘頭核酶更好的基因敲降效果，說明基于毒蛋白的細胞內篩選體系完全適于催化分子間核酶工具的進化和篩選，同時通過體內篩選獲得的活性大大增強的突變型錘頭核酶，目前用腺相關病毒為載體利用，TX-2作為新的分子工具在癌癥的基因治療研究工作已經(jīng)在該研究團隊展開。
該研究的主體工作由中國科學院成都生物所黃鑫博士完成，整個研究工作歷時四年的時間，同時感謝四川大學生物治療國家重點實驗室的莫顯明教授和趙永云博士對該研究工作的支持與幫助，該研究結果已發(fā)表在2019年 Nucleic Acids Research （IF: 11.561）上。