已有的研究表明，蛙類(lèi)歪頭病的致病因子為細(xì)菌，目前已經(jīng)從各類(lèi)病蛙中鑒定出十幾株病原菌，包括：米爾伊麗莎白菌（Elizabethkingia miricola）、腦膜膿毒性伊麗莎白菌（E. meningoseptica）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、醋酸鈣不動(dòng)桿菌（Acinetohacter calcoaceticus）等，并以伊麗莎白菌屬最為常見(jiàn)。這些菌株多為多重耐藥菌，其中一些菌株（如米爾伊麗莎白菌）與人類(lèi)臨床分離株（可引起新生兒腦膜炎）具有較高的親緣關(guān)系。當(dāng)前，雖然對(duì)于歪頭病致病因子的鑒定工作取得了一定進(jìn)展，但其病理機(jī)制卻極少有研究，且我們對(duì)于健康蛙類(lèi)所攜帶的本底病原菌的豐度及其潛在感染途徑等均不了解，這些研究的空缺使得養(yǎng)殖蛙類(lèi)歪頭病
的防治工作遲遲無(wú)法取得進(jìn)展。
為此，中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所江建平研究團(tuán)隊(duì)的朱未、常利明和趙春霖調(diào)查了四川境內(nèi)養(yǎng)殖黑斑蛙（俗稱青蛙）的歪頭病爆發(fā)情況。發(fā)現(xiàn)疾病爆發(fā)的蛙場(chǎng)內(nèi)至少存在兩種類(lèi)型的病蛙：其中一種僅表現(xiàn)出歪頭的癥狀，其運(yùn)動(dòng)平衡喪失，大量溺死；另一種同時(shí)表現(xiàn)出歪頭、白內(nèi)障和浮腫等癥狀，繼而于陰暗處病死（圖1）。通過(guò)比較無(wú)癥狀個(gè)體、歪頭個(gè)體和“歪頭+白內(nèi)障”個(gè)體的腦、眼球和消化道菌群發(fā)現(xiàn)，米爾伊麗莎白菌是這些病蛙的致病因子，其在兩種病蛙的腦中均具有很高的豐度，而僅在“歪頭+白內(nèi)障”個(gè)體的眼球中具有高豐度。所有個(gè)體的消化道菌群中米爾伊麗莎白菌的豐度極低，說(shuō)明其從消化道感染黑斑蛙的可能性較低。值得注意的是，多種其他類(lèi)型的歪頭病致病菌亦存在于養(yǎng)殖黑斑蛙的體表或腸道中，雖然其不是此次疾病爆發(fā)的致病因子，但是卻有引起歪頭病爆發(fā)的潛在可能。
圖1 不同癥狀的病蛙和微生物組成分析
組織病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，歪頭個(gè)體表現(xiàn)出明顯的腦膜血管充血，而“歪頭+白內(nèi)障”個(gè)體還額外表現(xiàn)出明顯的軟腦膜淋巴細(xì)胞滲透以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷；兩種病蛙均出現(xiàn)肝臟脂肪儲(chǔ)備降低的現(xiàn)象。病蛙與無(wú)癥狀個(gè)體的主要基因表達(dá)差異存在于腦組織中，且這些差異基因主參與免疫反應(yīng)，病蛙表現(xiàn)出免疫識(shí)別（NOD-like receptor signaling pathway and Toll-like receptor signaling pathway）、發(fā)炎反應(yīng)（TNF signaling pathway and Cytokine-cytokine interaction）和適應(yīng)性免疫應(yīng)答（B cell receptor signaling pathway）的全面激活。兩類(lèi)病蛙的基因表達(dá)在腦組織和肝臟中存在明顯差異。在腦組織中，“歪頭+白內(nèi)障”個(gè)體表現(xiàn)出強(qiáng)烈的天然免疫和炎癥應(yīng)答，且急性期蛋白的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高；在肝臟中，“歪頭+白內(nèi)障”個(gè)體同樣表現(xiàn)出更顯著的急性期蛋白表達(dá)上調(diào)和能量代謝基因下調(diào)。這些結(jié)果共同提示兩種病蛙處于腦部感染的不同病理階段。結(jié)合人細(xì)菌性腦膜炎的病程，我們推測(cè)歪頭個(gè)體處于軟腦膜侵入和感染的早期，還未引發(fā)腦膜炎；由于未發(fā)現(xiàn)歪頭個(gè)體的肌肉存在明顯的病理和基因轉(zhuǎn)錄變化，因此我們推測(cè)歪頭癥狀和運(yùn)動(dòng)失衡可能是源于神經(jīng)系統(tǒng)感染。而在“歪頭+白內(nèi)障”個(gè)體中，感染已經(jīng)引起腦膜炎，其所伴隨的系統(tǒng)性發(fā)炎可導(dǎo)致“血眼屏障”的突破（眼部感染）和組織水腫，進(jìn)而解釋了為何“白內(nèi)障”癥狀的出現(xiàn)可以預(yù)測(cè)腦膜炎的發(fā)生（圖2）。
圖2 典型癥狀的病理機(jī)制
基于這些結(jié)果，我們?yōu)橥犷^病的預(yù)防提出以下幾點(diǎn)建議：
1.出現(xiàn)歪頭癥狀時(shí)病原菌已入侵腦膜，抗生素治療所導(dǎo)致的細(xì)菌裂解可能促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加速病蛙的死亡，因此該疾病應(yīng)以預(yù)防為主；
2.由于多種致病菌被黑斑蛙正常攜帶，監(jiān)測(cè)黑斑蛙體表及養(yǎng)殖環(huán)境的微生物組成和豐度或可預(yù)測(cè)歪頭病暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)；
3.有研究表明兩棲動(dòng)物在暴露于某些滅活的病原物之后仍可獲得免疫記憶，而伊麗莎白菌感染可激活黑斑蛙的適應(yīng)性免疫，我們或可嘗試使用滅活病原菌暴露的方式提前激活黑斑蛙對(duì)該病原菌的的免疫能力。
該研究得到了中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略先導(dǎo)研究項(xiàng)目(XDA19050201), 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31900327), 中國(guó)科學(xué)院西部之光人才培養(yǎng)項(xiàng)目(2016XBZG_XBQNXZ_B_008), 以及四川省科技廳基礎(chǔ)條件平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目(2019JDPT0020)的支助。近日，這項(xiàng)工作以常利明為第一作者，題為 “Microbiomic and transcriptomic insight into the pathogenesis of meningitis-like disease in cultured Pelophylax nigromaculatus”發(fā)表于水產(chǎn)領(lǐng)域經(jīng)典期刊Aquaculture。